酶聯(lián)免疫吸附測定法( Enzyme- Linked lmmunosorbentAssay; 簡稱ELISA) 是從酶標(biāo)記抗體技術(shù)發(fā)展起來的。1966 年, Nakane 和Avrameas 首先用酶標(biāo)記抗體在普通光學(xué)顯微鏡下定位抗原。1971 年, Engvall 和Perlman 以及Weeman 和Schuurs仿照放射免疫測定法( RIA) 的競爭性測定原理, 使酶標(biāo)抗原與待測標(biāo)本中的未標(biāo)記的抗原, 競爭結(jié)合一定量的抗體, 然后分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記抗原, 測定酶活性, 即可得到待測抗原量。次年, Engvall等改用酶標(biāo)記免疫球蛋白, 提高了標(biāo)記效率,避免了半抗原標(biāo)記困難的問題, 也簡化了操作手續(xù)[ 1] 。酶聯(lián)免疫吸附測定法結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測定法兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、適用范圍寬、檢測速度快以及費(fèi)用低等特點(diǎn)
1 ?? 酶聯(lián)免疫吸附的原理與方法
1. 1 ?? 原理
酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面; 測定時(shí), 將受檢樣品( 含待測抗體或抗原) 和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物; 反應(yīng)終止時(shí), 固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量( 免疫復(fù)合物) 即與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量成一定比例; 經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì), 加入酶反應(yīng)底物后, 底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物, zui后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量[ 2] 。
1. 2 ?? 方法
ELISA 常用的測定方法主要有直接法和間接法兩種: 直接法是酶標(biāo)記抗體與待檢測樣本中固相抗原直接作用, 加入底物后, 顯色( 其顏色深淺與樣本中抗原量成正比) ; 間接法是使已知抗原吸附在固相載體上, 與待檢測樣本中的抗體作用, 再加入酶標(biāo)記抗同種動(dòng)物抗體的免疫球蛋白( 抗抗體) , 使與特異抗原抗體復(fù)合物中的抗體作用, 加入酶底物, 顯色( 顏色深淺與樣本中抗體量成正比) [ 1] 。ELISA 有許多改良方法, 如雙抗體法( sandwichELISA) 、雙抗體夾心法( double_antibody sandwichtechnique) 、競爭法、酶- 抗酶法和均質(zhì)法( homogeneousELISA) 、生物素- 親和素放大系統(tǒng)( biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑點(diǎn)_ELISA ( dot_ELISA)等, 大致可分為三類: ( a) 測定抗體的間接法; ( b)測定抗原的雙抗體夾心法: ( c) 測定抗原的競爭法[ 3] 。前兩種方法主要用于測定抗體和大分子抗原, 適用于臨床診斷上, 而競爭法是測定小分子抗原的方法, 因而尤其適用于食品分析。競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法又可分為直接競爭法和間接競爭法。直接競爭法主要有三步: 抗體吸附于固相載體, 溫育后清洗?? 加入含有抗原的待測液及酶標(biāo)記的抗原, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果。間接競爭法主要有四步: 抗原吸附于固體載體, 溫育后清洗??加入含有抗原的待測液和抗體, 溫育后清洗?? 加入酶標(biāo)記抗體, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果[ 4] 。
1. 3 ?? 操作要點(diǎn)
影響ELISA 測定結(jié)果的因素主要包括以下幾點(diǎn):
( 1) 抗原包被的質(zhì)量。將抗原固定于聚苯乙烯微量反應(yīng)板中稱之為包被, 其效果好壞是影響抗原?? 抗體反應(yīng)的重要因素;
( 2) 非特異性反應(yīng)干擾的排除。除了設(shè)置稀釋液空白、陽性和陰性參比血清等對(duì)照外, 可采用包埋、封閉等預(yù)處理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白、明膠或吐溫- 20 等, 以減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生。高選擇性的單克隆抗體代替多克隆抗體也是提高ELISA 特異性的另一有效途徑[ 3] 。此外, 選擇表面積較大的固相載體, 也有利于提高ELISA 的敏感性;(3) 酶和交聯(lián)劑的選擇。用于ELISA 標(biāo)記的酶, 主要有辣根*酶(HRP) 、堿性磷酸酯酶(AKP) 、葡萄糖氧化酶( GO) 和半乳糖苷酶等, 而以HRP 用得較多。酶和抗體交聯(lián)可用免疫法( 酶-抗酶抗體) 或化學(xué)法, 常用化學(xué)法。一般來說, HRP與抗體的交聯(lián)現(xiàn)多采用改良Wilson?? s 法( 高碘酸鈉
氧化法) , AKP 與抗體交聯(lián)通常有戊二醛法和偶氮法[ 3] ;( 4) 酶底物。它本身要求無色, 反應(yīng)后能穩(wěn)定呈色。一般HRP 常采用鄰苯二胺( 產(chǎn)物桔黃色, 可穩(wěn)定呈色數(shù)小時(shí)) 或鄰聯(lián)甲苯胺作酶底物; AKP 常用對(duì)硝基苯磷酸鹽作酶底物。
2?? 酶聯(lián)免疫吸附在食品微生物檢測中的應(yīng)用
2. 1 ?? 細(xì)菌的檢測
檢測方法( 薄層層析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色譜法HPLC)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明直接競爭ELISA 及間接競爭LISA 具有靈敏、特異、簡便、快速、安全、價(jià)廉等特點(diǎn), 適合在我國基層推廣應(yīng)用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的單克隆抗體建立了檢測食品( 玉米、花生、小麥、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 間接競爭法。該方法zui低檢出濃度為0. 0lng/ g, 敏感范圍為0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率為83. 0~ 110. 3%, 精密度為2. 0~ 24. 3%。用該法測定了分布于淮河以北地區(qū)的1455 份樣品, 并對(duì)25 份植物油樣品用TIC 和ELISA 兩種方法進(jìn)行了對(duì)比測定。結(jié)果表明, 在方法靈敏度下( 5ng/ g ) TLC 均無AFB1 檢出, 而ELISA 法AFB1 檢出率為96%, ELISA法的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法。黃薇等[ 15]( 2002年) 運(yùn)用ELISA 并使用試劑盒對(duì)292 份樣品進(jìn)行了黃曲霉素B1 的檢驗(yàn), 并與薄層法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明: 回收率為72% ~ 95% , 變異系數(shù)為2. 76% , 與薄層法相比, 該法快速、簡便、靈敏、安全。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有綜述性介紹[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介導(dǎo)的病毒的檢測
ELISA 方法一直被用于食品從業(yè)人員的甲肝、乙肝病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查[ 1. 17- 20] 。黃漢菊, 黃振武等[ 21]( 2001 年) 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)四川省克山病病區(qū)30 例潛、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG進(jìn)行檢測, 了解柯薩奇B 組病毒( CoxB) 感染與克山病的相關(guān)關(guān)系。表明病區(qū)潛、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。應(yīng)用ELISA 方法, 可將無明顯臨床癥狀的海綿狀病毒( BSE) 感染動(dòng)物可被檢出, 經(jīng)對(duì)朊蛋白Westem 印跡法檢測牛及羊朊病毒蛋白的分析, 證明該方法是有效的。我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、合流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用, 建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù), 已形成試劑盒生產(chǎn)能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物檢測中發(fā)揮重要作用外, 已有用于有益微生物的檢測的報(bào)道,如采用間接ELISA 法進(jìn)行雙歧桿菌制劑產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)測[ 7] 。
2. 2 ?? 真菌毒素的檢測
劉濱磊等[ 13]( 1990 年) 繼李秀芳等( 1987 年) 建立反向直接競爭ELISA 法測定黃曲霉毒素B1(AFBl) 之后, 又建立了直接競爭ELISA、間接競爭ELISA 及生物素?? 親合素ELISA( BA- ELISA) 三種檢測食品中黃曲霉毒素B1 的方法。并將此四種方法進(jìn)行了比較。另外, 將ELISA 方法與其它AFB1檢測方法( 薄層層析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色譜法HPLC)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明直接競爭ELISA 及間接競爭ELISA 具有靈敏、特異、簡便、快速、安全、價(jià)廉等特點(diǎn), 適合在我國基層推廣應(yīng)用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的單克隆抗體建立了檢測食品( 玉米、花生、小麥、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 間接競爭法。該方法zui低檢出濃度為0. 0lng/ g, 敏感范圍為0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率為83. 0~ 110. 3%, 精密度為2. 0~ 24. 3%。用該法測定了分布于淮河以北地區(qū)的1455 份樣品, 并對(duì)25 份植物油樣品用TIC 和ELISA 兩種方法進(jìn)行了對(duì)比測定。結(jié)果表明, 在方法靈敏度下( 5ng/ g ) TLC 均無AFB1 檢出, 而ELISA 法AFB1 檢出率為96%, ELISA法的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法。黃薇等[ 15]( 2002年) 運(yùn)用ELISA 并使用試劑盒對(duì)292 份樣品進(jìn)行了黃曲霉素B1 的檢驗(yàn), 并與薄層法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明: 回收率為72% ~ 95% , 變異系數(shù)為2. 76% , 與薄層法相比, 該法快速、簡便、靈敏、安全。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有綜述性介紹[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介導(dǎo)的病毒的檢測
ELISA 方法一直被用于食品從業(yè)人員的甲肝、乙肝病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查[ 1. 17- 20] 。黃漢菊, 黃振武等[ 21]( 2001 年) 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)四川省克山病病區(qū)30 例潛、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG進(jìn)行檢測, 了解柯薩奇B 組病毒( CoxB) 感染與克山病的相關(guān)關(guān)系。表明病區(qū)潛、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。應(yīng)用ELISA 方法, 可將無明顯臨床癥狀的海綿狀病毒( BSE) 感染動(dòng)物可被檢出, 經(jīng)對(duì)朊蛋白Westem 印跡法檢測牛及羊朊病毒蛋白的分析, 證明該方法是有效的。我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、合流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用, 建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù), 已形成試劑盒生產(chǎn)能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物檢測中發(fā)揮重要作用外, 已有用于有益微生物的檢測的報(bào)道,如采用間接ELISA 法進(jìn)行雙歧桿菌制劑產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)測[ 7]

3 ?? 結(jié)語
自從上世紀(jì)60、70 年代ELISA 技術(shù)建立以來,無論是該方法本身的改進(jìn)方面, 還是其應(yīng)用領(lǐng)域的拓展方面都有了很大的進(jìn)步, 包括試劑的靈敏性、穩(wěn)定性和通用性的增強(qiáng), 自動(dòng)檢測儀器的開發(fā), 以簡捷、靈敏和微量化的情況下, ELISA 技術(shù)較之其它方法顯示了很大的優(yōu)勢。但同時(shí)它也不可避免地存在著一些缺陷, 如存在交叉反應(yīng), 對(duì)試劑的選擇性高, 難于同時(shí)分析多種成分等。隨著有關(guān)研究和探索的不斷深入, 可以相信ELISA 技術(shù)在食品微生物檢測中將會(huì)發(fā)揮更為重要的作用。